安捷伦GCMS内标法定量简介

浏览: 101次 来源:网络整理 作者:佚名

2021-03-20 23:00:29

安捷伦GCMS内标法定量简介 安捷伦 GCMS 内标法定量简介(以5975 定量响应值不同的物质,由于其物理性质,化学性质(化学结构)的不同,在气 相色谱检测器(FID,TCD,FPD,ECD,MSD 等)上的响应会不同。相同量 的同种物质对不同检测器响应不同。相同量的不同物质对于同一种检测器 响应不同。在质量选择检测器(MSD)上,物质的物理结构不同,电离电 位不同,需要的电离能量不同四川快乐12 ,裂解碎片不同,裂解碎片产率不同,这样 得到的质量离子色谱图的峰面积或峰高也不同(当然总离子色谱图的峰面 积也不同)。直接用响应讯号定量,必然引起较大偏差。故引入响应因子 或校正因子。定量响应因子或校正因子对检测器形成的讯号加以校准,校 正后的峰面积可以定量的代表物质的纯度。例如图1 三个化合物的有不同的浓度和峰面积。 响应值S,即为某一物质(组分)在检测器所形成的讯号硬度(电信号,峰高,峰面积等, 本篇均采用峰面积为例, 包括下边的校正因子计 算,内标法估算等),例如一定质量(m)的某一物质通过检测器在工作站 或积分仪上形成峰面积为A,则可用下式表示: 绝对响应值S’ mi(式中:mi 组分的校正因子;Ai----i组分的峰 面积) 绝对响应值S 就是单位量物质通过检测器时形成的讯号硬度(电信号四川快乐12 , 峰高,峰面积等),也成为绝对灵敏度。

一个化合物的绝对响应值就是该 化合物的浓度除剖析这个校准混合物时该化合物的峰面积(或峰高)的值。 绝对响应值校准了检测器对不同化合物的响应能力。 当校准样和未知样品在同样的条件下剖析时,外标法是基本的定量方 法。未知样品的结果与校准样的结果相比较因而估算出未知物的纯度。 外标法使用绝对响应。响应因子从校准表中得到并可贮存。在剖析后 面的样品时,响应因子被用于估算化合物的纯度。使用这些估算方式必须 注意一点,即每次运行的进样量必须是一致的。或者讲每一组分的测量面 积乘以其已知的浓度得到各自的响应值。 例如图1 A=3000(假如单位为pA*sce)/100(假如单位为ng或ppm)=30 化合物的绝对响应值S’B=2500/80=31.25 化合物的绝对响应值S’C=4000/200=20 组分的面积乘以以响应值得到其浓度(或含量), 外标法优点是:快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可。但要 求:进样量、色谱质谱剖析操作条件严格不变。是属于绝对法。绝对响应 值的使用也是要求进样量、色谱质谱剖析操作条件严格不变。 所以引入相对响应值,用于内标法的估算(进样量,操作条件没有外 标法那样严格要求,是相对测定法,下面会晤到)。

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化合物i 的绝对响应 mi化合物s(基准物或内标物)的绝对响应值为 ms则化合物i 对于内标物s 的相对响应值:S Aims mi)(或者讲内标物的相对响应值等于1) 例如图1 中,假如化合物B 为基准物(或内标物),则相对于B,化合 定量校正因子校正因子是定量估算公式中的比列常数,其数学意义是单位面积所代 可用下式表示:绝对质量(或重量)校正因子 mi/Ai可以导入 mi Ai式中:mi 组分的校正因子;Ai----i组分的峰 面积 例如图1 0.033(与组分性质、仪器灵敏度等有关,例如外标法采用绝对质量校准因子 进行估算) 相对质量校准因子 miAs/(msAi)例如图1 中,假如化合物B 为基准物(或内标物),则相对于B,化合 1.04响应值和校正因子的关系是互为倒数:即 或Sf=1。实际上通常多采用校正因子来进行定量估算。 注:安捷伦的仪器使用绝对响应因子(用RF 表示)进行外标法定量, 别的仪器是绝对校准因子。实际上安捷伦的RF 就是通常的校正因子。 内标法简单的讲,内标法就是在待测的样品中确切加入一定量的内标物gc-ms内标,根 据被测物和内标物的量及其在(在质谱中是质量色谱图)色谱图相应的峰 面积比取出此被测定组分的纯度。

样品中加入内标物,利用被测物与内标物校准因子的比值不变来进行 定量的。 首先用被测物标准品和内标物配制标准碱液四川快乐12 ,求得定量响应因子或校 正因子: Aims miAs/(msAi)请参考前面的相对响应值和相对校正因子的反例。 在样品中确切加入内标物后,再由它和样品的峰面积来估算: mi =(Ai (在安捷伦上是mi=(Ai mi=(Ai 例如,在含未知物A,C的样品中加入100ppm*的内标物B,进样后 得到图2 的色谱图: 注:*例如,准确称取1.0000 样品,加入1000ppm(即0.1%)的内标 物化合物B 标准液0.1000g,即在样品中的内标浓度为: 1000ppm*0.1000/1.0000 126(ppm) mi=(Ai 126(ppm) 内标法的优点: 进样量不严格要求. 内标的加入清除了因为进样量、仪器不稳定等因 素带来的系统误差。只对欲剖析的组分峰做校准 内标法的缺点: 每次须要确切称量内标物和样品。 必须加一个组分进到样品,有可能降低面积测量误差。 作为内标的化合物其化学性质和保留时间最好都应和目标化合物相 似(理想状态)。但它必须能按保留时间或 值来和样品分辨。

同位素标记目标化合物是一个理想的内标物,它可以由其离子和目标 化合物的M/Z 值区别开。 选择内标物的标准 样品中不存在化学性质与样品相像 与样品有相同的含量范围 不会与样品发生反应 在感兴趣组分附近流出 可得到分离良好的、干净 利落的峰* 色谱性质稳定 可迅速容易得到 *GC/MS 对于第6 项不要求。 如果有条件,运用同位素标记化合物做内标物,其化学性质、色谱特 性等都与目标化合物一致欧宝体育 ,因此校准精度更高。 二、积分 要确切定量,必须对色谱峰正确积分。 质谱工作站通过两种积分形式,即RTE 积分器(RTE Integrator)和化 学工作站积分器(ChemStation Integrator)。 RTE 积分器对相对简单的色谱 图(其中的峰太窄且已完全解析)提供了一种特别快速的积分。尤其适用 targetcompound analyses(目标化合物剖析)。缺省参数假定待积分的数 据是在整个色谱图范围内使用毛细管色谱柱色谱仪扫描到的数据的总距 (TIC)。如果选择适当的积分参数,则RTE 积分器即可处理采集 (SIM) 和积分目标,如在较小的保留时间窗口中测量内标化合物。 化学工作站积分器可以满足各类类型色谱图的积分,包括这些带有难 于处理的基线和负峰的色谱图。

通过设置积分参数(通常叫做积分风波) 可以控制积分过程。 根据须要,在数据剖析(Data Analysis)的色谱(Chromatogram)菜 单的Select Integrator 下面选择RTE 或ChemStation 积分。在MS Signal Integration Parameters设置积分参数。 我喜欢用ChemStation 积分器。处理各种各样的峰较为便捷且积分准, 直观,特别峰型复杂时。但手动编辑定量时,用RTE 较好。 有关两种积分方式的各项参数的意义及使用方式请参考工作站中有 关内容。这里就不罗嗦了。 总之,在编辑定量校准表,建立校正曲线,进行内标法估算时,要设 置合理的积分参数,正确积分(必要时,采用自动积分)以得良好的结果。 三、建立内标定量数据库(单级校准)示例 以演示数据文件 C:\MSDCHEM\1\DATA\EVALDEMO.D 为例说明怎样让 用手动定量设置创建定量数据库。 调用(load)evaldemo.d 质谱数据文件。 并选用合适的积分参数积分。 这里假设四个化合物的浓度如下:保留时间RT(min) 化合物 含量(ppm) 5.28 十二烷(dodecane) 20 6.43 联苯 (diphenyl) (内标) 30 7.74 4-氯吡啶 (4-chlorodiphenyl) 26 9.78 十六酸甲酯 (methyl palmitate) 23 使用手动定量设置创建定量数据库,选择Calibate/AutoQuant Setup 如果使用RTE积分,就在Use RTEINT 前面对勾。

如果选用ChemStation 积分,则去除。 定量数据库全局参数(Quantitation Database Globals) 窗口拿来编辑 在当前的剖析 中所有化合物的有关信息。在这里可以设置定量报告、峰 位置、新化合物资料等参数。这些参数设置是针对所有化合物的,但对某 具体化合物可以改变设置。 Calibration Title(校准标题):如果乐意输入一个标题(可选)。这个标 题将显示在每位定量报告的标题栏中。Default Multiplier(缺省的因数): 在复印报告前欧宝体育 ,所有未知样品定量估算结果除以这一给定的因数。 Default Sample Concentration(缺省的样品含量):在复印报告前对未 知样品的估算结果要乘以这个含量再乘100。在最后的报告中含量单位换 值说明在报告中样品含量用绝对值表示而不是用百分率。Reference Window Non-ReferenceWindow(参考峰窗口/非参考峰窗 口):用来确定在定量数据库中指定的峰是否在要处理的数据文件中,单 或分钟。如果设定值是5%表示要处理的峰其保留时间必须是在 定量数据库中保留时间 2.5%之内。

若设置是5分钟,表示将要处 理的峰其保留时间是在定量数据库保留时间的 2.5分钟之内。 Reference window 用于作为时间参照(内标物)的峰。在一个完整的 色谱图中,参考峰拿来校准保留时间的甩尾。工作站首先找到参考峰,确 定参考峰的甩尾,在将这一甩尾值用于其他峰。 non-reference window 用于其他所有化合物。这些值范围通常大于预期的保留时间附近+/-缺省 时间值范围。 Correlation Window:用于处理当前数据文件,以确定积分时找到的目 标化合物和限定讯号,是否为同一色谱峰(具有相同保留时间)。对扫描 方式 (scan) 的数据典型值为0.05,而对 SIM 方式的数据可能须要 0.025。 点OK:出现Choose Compound Name 小窗口 在ChooseCompound Name 选dodecane 点Add 加入到校准表;接着 Biphenyl,内标物,点ISTD;接着Add 4-ChloroBiphenyl 及Methyl Palmitate。 Add(添加) 将该化合物、其目标离子和三个限定离子添加到定量数 Skip(跳过)指示软件显示在数据文件中找到的下一个化合物。

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ISTD(内标) 将该化合物添加到定量数据库中,并将其标示为内标。 10出现”File has beenquantitated, Quantitate now?”点是(y) 在New Level ID 中输入1,在Compound Concentration 中输入20。 图11 点Do Update (执行更新)亚博APP安全有保障 ,可以见到随即出现Edit Compounds(编辑 化合物)对话框,其中显示有定量数据库中化合物的完整列表。 Biphenyl(标识为内标的化合物)已经联通到了列表的底部(尽管它 在组内的Dodecane 化合物以后流出)四川快乐12 ,并装在一个其名称后面带黄色矩形 标志的黄瓶内。 带黄色矩形标志的黄瓶表示其为内标。 内标必须坐落引用它的化合物之前,除此之外,在定量数据库中次序 并不重要。 图12 在上图中,可以identification 下面见到化合物名称Dodecane, 浓度单 位ppm。 Signal Quantitation下边有保留时间,定量离子57.10, 参比离子71.15,43.05, 85.15(这是手动选择和添加的)及其相对丰度等 信息。 一旦设置了数据库,即可直接修改编辑化合物gc-ms内标,这个烩面是拿来对化 合物的每一特点进行更改。

窗口的标题显示化合物在数据库中的编号位置。 这里列举了用于鉴别(Identification)目标化合物所需的大部分信息。 Ret Time (Retention Time Information):以分钟为单位输入保留时间。 Extract Signals from:缺省值是在此之前于Quant Database Globals 输入的预期保留时间范围。输入一个时间范围(以分钟计)或一个百分率,由这一时间范围来确定适用于对峰的左侧进行积分的基线位置。该时间窗 口转化成相应于预期保留时间的一段时间范围(以分钟计)。时间范围的 相对值被存入方式中。在前面的再校准中,如果峰的保留时间偏斜,该窗 口会随峰联通。 Quantitation Options:内标可以被指定为时间参考峰。当 没有保留时间飘移时,不需要时间参考峰四川快乐12 ,只有当设定某化合物为内标时, ISTD Concentration(内标含量)框才能显示。在该框中设定该样品中内标 物的含量。 Measure response by:根据估算峰面积或峰高进行测定,这一参数最 初是以全局参数设置的。 Ident By...:确定怎样从多个限定标准中选出最适当的。

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Anthracene(蒽) Phenanthrene(菲)适合这一情况。它们的质谱图十分一致。而保留时间只差 0.2-0.3 分钟。软件怎样判别何者是 Anthracene,何者是 Phenanthrene 点Calibration,把Conc下边的含量数字改成相应的20(dodecane 用改,相同);4-ChloroDiphenyl 为26;Methyl Palmitate 为23。 内标法的横座标为目标化合物浓度与内标物浓度的比值( Concentration Ratio),纵座标为目标化合物的响应值与内标物响应值 的比值(Response Ratio)。 (注:外标法的标准曲线横座标为浓度,纵座标为响应值。) 点OK, 图14 点Edit Compounds 中的“确定”,左下角会出现Finished setting up calibration table,完成。并保存方式,(否则,关掉工作站后,已构建的内 标定量数据库将会遗失)。这样就完成了构建内标定量数据库(单级校准) 可以在Calibrate菜单下边的Edit Compounds 查看或更改化合物的相关 信息。 四、手动构建内标定量数据库(单级校准)。

上面是手动构建内标定量数据库(单级校准)的示意过程,下面简略讲 一下自动的方式。 以ALKDEMO.D 数据为例。 15图16 SetUp Quantitation步入 图17 OK图18 图19 双击键盘右键选择目标化合物 输入化合物名称 如果该化合物是内标,选择内标框。注意最先输入内标化合物 字标选择目标离子和限定离子,同时击滑鼠左右键单击 “Save” 保存这 一信息 保存最后一个化合物后单击 “Exit” 请注意 重要!!切记!! 内标位置须领先于以它为内标的其它化合物!! 20图21 在File has beenquantitated. Quantitate now?对话框按是(y) 后面 的步骤和手动构建的步骤一样。

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